消毒剂效力验证的实用指南与常见问题解决

消毒剂的习惯定义：能消除以细胞繁殖形态出现的微生物污染的化学物质。

消毒剂的分类定义（USP29 <1072>）：

① 抗菌剂（Antiseptic)

② 化学杀菌剂 (Chemical Disinfectant)

③ 清洁剂 (Cleaning Agent)

④ 消毒剂 (Disinfectant)

⑤ 卫生洗涤剂 (Sanitizing Agent)

⑥ 杀孢子剂 (Sporicidal Agent)

⑦ 灭菌剂 (Sterilant Agent)

一、消毒剂配制及其注意事项

• 按供应商的使用说明进行配制和储存 (纯化水、注射用水）
• 洁净室及相关受控环境使用，应进行除菌过滤。
• 温度提高，杀菌效力增大。效力验证时，在常温下配制。

二、影响消毒剂效力的因素

pH；温度，浓度；材质和附着物质；溶剂（水）；接触时间；微生物的类型和数量；

三、消毒剂作用机理

• 钝化胞内酶活性，影响细胞的正常代谢（如酚类）
• 阻断物质运输通道（如季铵盐类（+ 电荷），附着于细胞膜特定部分（- 电荷）
• 破坏微生物细胞（膜）的结构和功能（如醛类、含氯、过氧化物）

四、微生物对消毒剂的耐受性受以下几方面因素的影响

• 形成生物膜（粘性多糖物质）
• 消毒剂的相互作用（中和反应）
• 固有耐受性和概率残存
• 致死剂量

五、微生物抗力由小到大排列

一般为细菌繁殖体 -- 真菌繁殖体 -- 真菌孢子 -- 病毒 -- 分枝杆菌 -- 细菌芽孢

六、消毒剂的选择考虑如下因素

• 需控制的微生物的类型和数量
• 市售消毒剂的抗菌谱
• 消毒剂的品牌
• 浓度、使用方法和接触时间
• 待消毒物体的材质和对消毒剂的兼容性
• 可能影响杀菌效力的表面有机物数量
• 反复使用，对设备表面的腐蚀程度
• 对操作者的安全性
• 和清洁剂 / 其它消毒剂的相容性
• 交替使用方案和对产品的影响

七、消毒剂验证步骤

第一步：在实验室对代表细菌在规定的使用浓度和规定的作用时间进行确认。

第二步：应用不同材质的载体，进行模拟试验

第三步：完成验证报告，形成 SOP。

八、验证用菌种

金黄色葡萄球菌、铜绿色假单胞菌、沙门氏菌、大肠埃希菌、枯草杆菌、白色念珠菌、黑曲霉、环境分离菌。

菌种选择的原则：代表性，普遍性，标准菌种。(环境中常见的污染菌）。菌种的要求：不得超过 5 代。

采用适宜的方法保存。

九、挑战微生物 (USP29)

十、准备性试验

选择适合的中和剂：Letheen 肉汤、D/E 中和肉汤（酚类，季铵盐类）、TAT 肉汤基础 + 吐温 20 + 卵磷脂 + 胰蛋白胨

10.1. D/E 中和肉汤配方（每升）

胰蛋白胨 5g；酵母膏 2.5g；葡萄糖 10g；硫乙醇酸钠 1g；硫代硫酸钠 6g；亚硫酸氢钠 2.5g；吐温 805g；卵磷脂 7g；溴甲酚紫 0.02g；最终 pH7.6±0.2 于 25℃；

10.2. 准备性试验之中和剂毒性

将 10 ～ 100CFU 的微生物加入到中和剂中；薄膜过滤，冲洗，培养，计数￠与菌液对照组比较，回收率应 >70%

10.3. 准备性试验之中和效力

使用中稀释检测（use-dilutiontests)(对不同浓度下，对消毒剂的效力进行筛选；针对不同标准菌株和环境微生物，确认接触时间）

• 将消毒剂和中和剂混合（记录时间）
• 加入 10 ～ 100CFU 微生物￠薄膜过滤，冲洗，培养，计数
• 与菌液对照组比较，回收率应 >70% 验证方法

薄膜过滤法：菌悬液和消毒剂直接混合，在不同的时间间隔条件下过滤，培养后评价。

十一、验证准备

测试菌液准备：增菌过夜，并调整至 106 ～ 108CFU/ml

消毒剂稀释至规定浓度：分装 10ml 于若干无菌试管中；试管上标注消毒时间：如“1 分钟组”，“5 分钟组”，“10 分钟组”或其他要求的时间段。

配制中和剂（分装 100ml，300ml）验证步骤：

接种：接种各验证菌种至盛有待验证消毒剂的试管（使接后浓度 >104CFU/ml)，混合均匀，并立即开始计时。

中和、过滤：将消毒剂倾入 100ml 中和剂中，混合，稀释（如需要），过滤，然后用 100ml 中和剂清洗滤膜，滤过 3 次。

阳性对照：用无菌水代替消毒剂，步骤同上。

培养和计数：取下滤膜放入规定的培养基平板，在规定的温度、时间培养后，记数。和阳性对照相比，微生物数量下降应至少 3 个对数值（细菌芽孢至少 2 个对数值）。

表面挑战试验（surfacechallengetests)

• 使用标准菌株和典型环境分离微生物
• 选择合适的浓度和接触时间，进行试验
• 获得挑战微生物数量下降的对数值
• 对使用新消毒剂前后环境微生物的检出频率和数量进行统计学评估（无菌生产区域、GMP 要求）
• 根据设施的实际情况，选择不同材质的载体（玻璃，不锈钢，塑料薄膜，乳胶，墙面涂料，地面材质）
• 接种，并确认实际数量
• 接触杀菌、中和、过滤。

十二、正确使用消毒剂

• 稀释消毒剂时应用纯化水、注射用水
• 设备使用后彻底清洁
• 将环境常见菌列入验证范畴
• 轮换使用不同的消毒剂，消毒剂间要用无菌水充分清洗
• 消毒的 SOP：配制、使用、纠正、防护等
• 供应商的审核和确认

十三、消毒剂的文件

• 标准操作规程 SOP
• 消毒剂配制记录
• 消毒剂使用记录
• 消毒剂标签消毒剂文件，应该等同于原始记录。

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